PAS糖原染色-CBA流式多因子-明胶酶谱MMP-上海研谨生物科技有限公司

β-半乳糖苷酶（β-GAL）活性檢測試劑盒說明書

注意：正式測定前務必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定。

貨號：100T/48S

產品內容：

提取液：液體 100mL×1 瓶，4℃保存。

微量法

試劑一：粉劑×1 瓶，-20℃保存；臨用前每瓶加入 2.5mL 雙蒸水，充分溶解備用；用不完的試劑仍-20℃保存。

試劑二：液體 4mL×1 瓶，4℃保存。試劑三：液體 15mL×1 瓶，4℃保存。

標準液：液體 1mL×1 支，4℃保存，5μmol/mL 對硝基苯酚溶液。

產品說明：

β-GAL(EC 3.2.1.23)廣泛存在于動物、植物、微生物和培養細胞中，能夠催化β半乳糖苷化合物中β半乳糖苷鍵水解，此外還具有轉半乳糖苷的作用。β-GAL不僅可為植物的快速生長釋放儲存的能量，還能在正常的多糖代謝、細胞壁組分代謝以及衰老時細胞壁降解過程中催化多糖、糖蛋白以及半乳糖脂末端半乳糖殘基的水解，釋放自由的半乳糖。

β-GAL 分解對-硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷生成對-硝基苯酚，后者在 400nm 有最大吸收峰，通過測定吸光值升高速率來計算β-GAL 活性。

試驗中所需的儀器和試劑：

可見分光光度計/酶標儀、臺式離心機、水浴鍋、可調式移液器、微量玻璃比色皿/96 孔板、研缽、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、粗酶液提取：

1、細菌或培養細胞的處理：收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照每 500 萬細菌或細胞加入 1mL 提取液，超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率 20％，超聲 3 秒，間隔 10 秒，重復30 次），15000g，4℃，離心 20 分鐘，取上清，置冰上待測。

2、組織的處理：稱取約 0.2g 組織，加入 1mL 提取液進行冰浴勻漿；15000g，4℃，離心 20 分鐘， 取上清，置冰上待測。

3、標準液的處理：用蒸餾水將標準液稀釋至 200、100、50、25、12.5、6.25、0nmol/mL.

二、測定步驟：

1、分光光度計或酶標儀預熱 30min 以上，調節波長至 400nm，蒸餾水調零。

2、樣本測定，（在 EP 管或 96 孔板中依次加入下列試劑）：

試劑名稱（μL）測定管對照管標準管

試劑一25

蒸餾水25

試劑二3535

樣本1010

迅速混勻，放入 37℃保溫 30min

標準液70

試劑三130130130

充分混勻， 400nm 處測定吸光值 A，計算ΔA=A 測定-A 對照。每個測定管需設一個對照管。三、β-GAL 活性計算：

根據標準管的吸光度（x，減去濃度為 0 的標準管 OD 值）和濃度（y，nmol/mL）建立標準曲線，將△A 帶入標準曲線中，計算樣品生成的產物量（nmol/mL）。

1.按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每 mg 組織蛋白每小時產生 1nmol  對-硝基苯酚定義為一個酶活力單位。

β-GAL 活力(nmol/h /mg prot)=(y×V 反總)÷(V 樣×Cpr)÷T=14×y÷Cpr 需要另外測定，建議使用本公司 BCA 蛋白質含量測定試劑盒。

2.按樣本鮮重計算：

單位的定義：每 g  組織每小時產生 1nmol 對-硝基苯酚定義為一個酶活力單位。

β-GAL 活力(nmol/h /g 鮮重)＝(y×V 反總)÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T=14×y ÷W

3.按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每 1  萬個細菌或細胞每小時產生 1nmol 對-硝基苯酚定義為一個酶活力單位。

β-GAL 活力(nmol/h /104 cell)= (y×V 反總)÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T=0.028×y

Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；V 反總：反應體系總體積，0.07mL；V 樣：加入反應體系中樣本體積，0.01mL；V 樣總：加入提取液體積，1mL；W：樣本質量，g； 500：細胞或細菌總數， 500 萬；T：反應時間，0.5h。

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