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介紹免疫沉淀CHIP的三個實驗步驟
點擊次數(shù)：1361 更新時間：2021-10-23
在生理狀態(tài)下把細(xì)胞內(nèi)的DNA與蛋白質(zhì)交聯(lián)在一起，通過超聲或酶處理將染色質(zhì)切為小片段后，利用抗原抗體的特異性識別反應(yīng)，將與目的蛋白相結(jié)合的DNA片段沉淀下來，以富集存在組蛋白修飾或者轉(zhuǎn)錄調(diào)控的DNA片段，再通過多種下游檢測技術(shù)（定量PCR、基因芯片、測序等）來檢測此富集片段的DNA序列。(檢測相關(guān)技術(shù)服務(wù)：Real-timePCR技術(shù)服務(wù)、基因芯片及結(jié)果驗證服服務(wù)、高通量測序及結(jié)果驗證服務(wù))
免疫沉淀CHIP技術(shù)實驗步驟
染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)包括3個獨立的步驟，即固定、沉淀和檢測。
1、固定
甲醛能有效的使蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)-DNA，蛋白質(zhì)-RNA交聯(lián)，形成生物復(fù)合體，防止細(xì)胞內(nèi)組分的重新分布。首先在體內(nèi)用甲醛固定DNA和蛋白質(zhì)復(fù)合物，需要注意甲醇的交聯(lián)時間，如果過長，細(xì)胞染色質(zhì)難以用超聲波破碎，影響ChIP結(jié)果，而且實驗材料也容易在離心過程中丟失；交聯(lián)時間如果過短，則交聯(lián)不*，產(chǎn)生假陰性。交聯(lián)反應(yīng)可加入甘氨酸終止。然后用化學(xué)（微球菌酶）或者機(jī)械（超聲波）的手段將其隨機(jī)切成一定長度的染色質(zhì)小片段（200～1000bp）。
2、免疫沉淀
利用目的蛋白質(zhì)或者目的蛋白質(zhì)上標(biāo)簽的特異性抗體，通過抗原和抗體反應(yīng)形成DNA－蛋白質(zhì)－抗體復(fù)合體，然后沉淀此復(fù)合體，特異性地富集目的蛋白結(jié)合的DNA片段。
3、目的片段的純化與檢測
經(jīng)過熱處理及交聯(lián)，釋放共沉淀的DNA；再將DNA片段純化后，對沉淀的DNA樣品進(jìn)行檢測。目前檢測方法主要有3種：第1種是比較沉淀的模版與陰性和陽性對照PCR信號強(qiáng)度的普通PCR實驗，或者相對精確的定量PCR方法。第2種是將沉淀的DNA與DNA微陣列芯片雜交（ChIP-on-ChIP），以檢測多基因軌跡全部的相互作用。第3種是高通量DNA測序分析。
